光纤是现代医学临床应用中的重要工具，可以在最小侵入程度的条件下进入狭小空间，向特定区域传输激发光并收集光信号，实现显微成像；同时，光纤探针也可直接用作外科手术工具。将非线性光学成像与光纤传输相结合可以实现更加高效的内窥成像。本期介绍两个基于梯度折射率多模光纤的非线性光学内窥镜系统。
【资料图】
第一个系统将双光子（TPEF）成像系统与飞秒激光消融手术（FLA）集成于同一个光纤探针。如图1所示，中心波长在1030nm的光纤激光在PBS处分为照明光束和参考光束。照明光束部分放置了空间光调制器（SLM），并将调制平面成像到光纤的输入端。光纤另一端利用透镜对将光纤的输出成像到CMOS的探测阵列上。调节不同波前输入并记录输出，计算出传输矩阵（TM），就可以在远端用SLM控制输出光斑。剩余的光路部分用于研究聚焦后光束的性质，检验是否胜任FLA手术脉冲传输。脉宽通过双光子干涉自相关仪来测量，光路中放置翻折镜，用来切换操作区域的明场成像。双光子荧光信号收集利用双色镜同步进行，通过透镜聚焦到PMT，成像结果用于引导手术操作。
图1 集成光纤探针系统示意图［1］
利用上述系统测试了两种梯度折射率（GRIN）光纤，芯径分别是200um和400um。实验测量了三种不同脉宽下的聚焦效率以及焦点处峰值强度随输入能量的变化，两种光纤的最大聚焦效率都在28％左右，考虑到测量条件限制，已经接近最优状态。
系统中远端的聚焦则基于测量传输矩阵，但是当脉冲能量超过临界值时，会产生非线性效应，使得通过传输矩阵实现的光束扫描质量下降。为减少非线性积累，作者在后续成像中选用了长度为10cm、芯径为400um的GRIN光纤，焦点尺寸为2．3 μm，视场大于200 μm。
此外，全系统无透镜聚焦、无机械扫描，探头尺寸在200 ～ 400 μm。随后作者对小鼠耳蜗样本进行了FLA与TPF的成像实验。图2为染色后的小鼠耳蜗毛细胞的双光子成像结果，b为黄框部分放大图，c为选择性消融掉了一个细胞后的对比图，消融可以发生在7×7um2的区域，而不影响相邻细胞的荧光信号。
图2 集成探头FLA手术效果 ［1］
第二个系统是基于GRIN光纤的相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）显微镜。CARS在组织形态成像的基础上还增加了化学对比成像，特别适合于区分细胞中脂肪、蛋白质等成分。
如图3所示，光源采用波长在830－820nm的蓝宝石激光器，一部分用来泵浦OPO，产生661－668nm的泵浦光，另一部分作为斯托克斯光。经由延时装置和双色镜使两束光时空重合，后经一组消色差透镜扩束进入SLM。波前控制的光路与前一系统一致，但增加了D形镜及偏振控制单元来完全控制输入光的偏振，对传输矩阵求解更完备，可提高激发光的利用率。
光路中利用LED和相机获得明场成像以便定位样品。样品产生的CARS信号既可以前向收集，也可以背向收集。所用GRIN光纤的芯径为50um，包层为125um，NA为0．29，长度控制在30－35mm。在泵浦波长和斯托克斯波长下，纤芯中心附近形成的光斑的半高宽分别为1．23和1．55 um。
图3 CARS光纤内窥成像系统示意图［2］
图4（a－c）是2umPS珠子团簇正向及背向CARS成像的结果，前向传输信号比背向强50倍，但背向收集信号依然可以成像并定位2um珠子位置信息。图（d－g）显示了在两种物质的峰值频移处分别测量的结果，组合图在同一幅图中获得了两种珠子的位置信息。
图4 PMMA／PS微珠成像效果示意图［2］
总之，本期介绍了两个基于GRIN多模光纤的非线性光学内窥镜系统，均采用波前调制来完成无光学及机械元件的远端扫描及聚焦，最终实现了生物样本中的高分辨内窥成像，对搭建应用于生医方向的多光子小型化显微镜具有借鉴意义。
参考文献：
［1］ Kakkava， Eirini， et al． ＂Selective femtosecond laser ablation via two－photon fluorescence imaging through a multimode fiber．＂ Biomedical optics express 10．2 （2019）： 423－433．
［2］ Tr?g?rdh， Johanna， et al． ＂Label－free CARS microscopy through a multimode fiber endoscope．＂ Optics express 27．21 （2019）： 30055－30066．
原文标题 : 多光子显微镜成像技术之二十四 基于梯度折射率多模光纤的非线性光学内窥镜
